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    RIP實驗流程介紹
    更新時間:2022-03-29 點擊次數:1213次
      RIP技術主要是運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白複合物沉澱下來,經過分離純化就可以對結合在複合物上的RNA進行q-PCR驗證或者測序分析。RIP是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術,是了解轉錄後調控網絡動態過程的有力工具,可以幫助茄子视频破解版發現miRNA的調節靶點。根據需求,金開瑞可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作驗證RIP技術服務。
     
      應用:
     
      1.用抗體或表位標記物捕獲細胞核內或細胞質中內源性的RNA結合蛋白;
     
      2.防止非特異性的RNA的結合;
     
      3.免疫沉澱把RNA結合蛋白及其結合的RNA一起分離出來;
     
      4.結合的RNA序列通過定量RT-PCR或高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定。
     
      RIP實驗流程:
     
      (一)細胞裂解液獲取
     
      A.單層細胞或者貼壁細胞處理
     
      1.冷PBS清洗培養皿或培養瓶中的細胞兩次
     
      2.加入冷PBS後用細胞刮將細胞刮下來,收集至enpendoff管
     
      3.1500rpm,4℃離心5min,棄上清,收集細胞
     
      4.用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞,吹打均勻後於冰上靜置5min
     
      5.每管分裝200ul細胞裂解液,貯存於-80℃
     
      B.懸浮細胞處理:先收集細胞再計數,然後清洗裂解
     
      C.組織樣品處理
     
      1.冷PBS清洗新鮮切下的組織三次
     
      2.加入冷PBS後,用勻漿器或其他細胞分離設備使組織分散為單個細胞,計數
     
      3.1500rpm,4℃離心5min,棄上清,收集細胞
     
      4.用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞,吹打均勻後置於冰上靜置5min
     
      5.每管分裝200ul細胞裂解液,貯存於-80℃
     
      (二)磁珠的準備
     
      A.實驗前準備
     
      1、enpendoff管
     
      2、磁力架
     
      3、冰盒,RIPWashBuffer置於冰上
     
      4、抗體,置於冰上
     
      5、渦旋震蕩器
     
      6、槍、槍頭放於超淨台照射30min,槍噴DEPC水
     
      B.磁珠準備過程
     
      1.重懸磁珠
     
      2.標記實驗所需的enpendoff管,樣品包括目的樣品,陰性對照與陽性對照
     
      3.吸取50ul重懸後的磁珠懸液於每個enpendoff管
     
      4.每管加入500ulRIPWashBuffer,渦旋震蕩
     
      5.將enpendoff管置於磁力架上,並左右轉動15°使磁珠吸附成一條直線,去上清,重複一次
     
      6.用100ul的RIPWashBuffer重懸磁珠,加入約5ug相應抗體於每個樣品中
     
      7.室溫孵育30min
     
      8.將enpendoff管置於磁力架上,棄上清
     
      9.加入500ulRIPWashBuffer,渦旋震蕩後棄上清,重複一次
     
      10.加入500ulRIPWashBuffer,渦旋震蕩後置於冰上
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